非饮用水中嗜肺军团菌酶底物法的检测方法

来源:www.haiyansea.cn         发布时间:2021-01-25

(1)样本处理与培养

根据Legiolert说明书进行。在无菌微管中加入1mL Legiolert 预处理液及1 mL样品,涡旋混匀后室温下温育1 min,转移至100 mL 溶解的Legiolert试剂中,充分混合并倒入Legiolert 量盘,用SealerPlus 程控定量封口机密封。

将密封好的Legiolert定量盘纸侧向下置于(37±0.5)℃培养箱中,培养7 d。7 d后,定量盘中棕色孔或浑浊孔即为阳性孔。

嗜肺军团菌

(2)阳性孔确证试验

为了检验酶底物法的特异性,对Legiolert定量盘中阳性孔进行确证试验。Legiolert定量盘共有6个大孔,90个小孔。如果阳性孔数小于10个,全部进行确证;如果阳性孔数大于10个,先选取10个(包括全部大孔及随机选取的小孔),再加上随机选取剩余阳性孔数的 25%进行确证。确证方法为使用无菌注射器抽取10 μL悬浮液,涂布BCYE和L-半胱氨酸缺失的 BCYE,35 ~ 37 ℃培养48 ~ 72 h,在BCYE上生长、L-半胱氨酸缺失的BCYE 上无生长的菌落进行生化鉴定、血清型别鉴定及real-timePCR 鉴定。

(3)酶底物法的计量结果

酶底物法采用MPN法确定样本中嗜肺军团菌含量,计算阳性大孔和小孔的数目,并从 LegiolertMPN 表获得所得MPN值。MPN是应用概率理论来估算细菌浓度,实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点,MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

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